Раздел 1

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ ЧЕЛОВЕКА

1.3. Онтогенетический уровень организации жизни

1.3.2. Основы генетики человека

1.3.2.17. Методы изучения наследственности человека

Секвенирование генома человека

Методы секвенирования - определения нуклеотидной последовательности ДНК. Конкуренцию двух способов секвенирования - методов Сенгера и Рича - Максема - время решил на каристь первого. В секвенуванні ДНК применяется преимущественно "shotgun"-стратегия (растет количество дорожек разделения, длина фрагментов увеличивается до 1000 последовательностей нуклеотидов, сокращается время разделения). Продукты полимеразной цепной реакции выявляются путем гибридизации с радиоактивным или флуоресцентной меткой и разделением на гели в случае необходимости количественного определения. Несмотря на преимущественное применение метода Сэнгера, поиски новых принципов секвенирование продолжаются. Существует секвенирования ДНК путем гибридизації на олігонуклеотидній мікроматриці Чипе). В настоящее время полностью определена последовательность нуклеотидов многих генов (α и β-цепей гемоглобина, гормонов: инсулина, гормона роста, хориогонического, соматотропина, пролактина). Преимущество ДНК-диагностики в том, что объектом исследования является молекулы ДНК, поэтому ее можно проводить не только на тех тканях, где работают ("экспрессируются") соответствующие гены, но и на других клетках организма, из которых можно выделить ДНК, и на любой стадии развития.

Досимптомна диагностика наследственных заболеваний, в том числе пренатальная диагностика, основанная на исследовании клеток плода, даже проембріональних стадий развития (гаметы, зиготы, эмбрионы). Для диагностики моногенных болезней у плода выделяют ДНК из биоптатов хориона (плаценты), клеток амниотической жидкости (амниоцитов) или из лимфоцитов крови пуповины. Основным источником ДНК для диагностики в постнатальном периоде являются лимфоциты крови.

Различают прямую и косвенную ДНК-диагностику наследственных болезней. Преимущества прямого метода - высокая (до 100 %) точность и возможность диагностики без анализа ДНК пробанда. Последнее особенно важно в случае пренатальной диагностики тяжелых, зачастую смертельных заболеваний. Прямая ДНК-диагностика заключается в выявлении конкретных повреждений в известном гене. Необходимым условием применения прямой ДНК-диагностики является идентификация гена, повреждения которого приводит к развитию заболевания.

Косвенный метод широко применяется для диагностики тех заболеваний, гены которых еще не идентифицированные, мутации неизвестны или трудно обнаруживаются. Единственным и непременным условием такой диагностики является данные о наличии молекулярных маркеров, расположенных близко от мутантного гена или в нем. Такими молекулярными маркерами являются полиморфные байта и гіперваріабельні по количеству однотипных простых повторов участков ДНК. Метод косвенной ДНК-диагностики более универсальный, однако уступает по точности прямому методу. Кроме того, он может быть применен при наличии пробанда, анализ ДНК которого позволяет установить, с каким именно молекулярным маркером каждой хромосомы родителей сцепленный мутантный ген.

Наиболее сложными для диагностики являются случаи патологии, обусловленные присутствием в кариотипе плода дополнительной маркерной хромосомы, что трудно идентифицируется традиционными цитогенетическими методами. Для изучения таких кариотипов используется метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) с ДНК-зондами, специфичными для отдельных хромосом или их участков, что позволяет идентифицировать аберантні хромосомы и анализировать анеуплоидии по інтерфазними ядрами, что существенно облегчает анализ мозаицизма хромосом.

Таким образом, перспективным является исследование содержания в крови беременной, начиная с 6 недели, белка PAPA (pregnancy associated protein А), использование раннего скрининга маркерных сывороточных белков беременной и УЗИ плодов первого триместра; анализ кариотипа клеток плода, находящихся в крови матери; проведение цитогенетичної диагностики хромосомных болезней на передімплантаційних зародышах человека.

Молекулярной диагностике доступны около 20 моногенных болезней (муковисцидоз, миодистрофия Дюшена, гемофилия А, В, фенилкетонурия, болезнь Віллібранда, бета-талассемия и др.). В 1997 году начата ДНК-диагностика патологии в внутриутробном периоде (муковисцидоз, миодистрофия Дюшена, фенилкетонурия, синдром ломкой Х-хромосомымы, гемофилия и др.)

Одним из наиболее важных практических достижений молекулярной генетики является разработка методов ДНК-диагностики, что без преувеличения революціонізувало всю систему медико-генетического консультирование. Внедрение ДНК-диагностики имеет не только большое медицинское, но и социально-экономическое значение, способствует охране генетического здоровья населения и уменьшению "генетического отягощения" популяции.