Раздел 1

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ ЧЕЛОВЕКА

1.2. Молекулярно-генетический и клеточный уровни организации жизни

1.2.3. Наследственный аппарат еукаріотичних клеток и его функционирования на молекулярном уровне

1.2.3.16. Генная инженерия и биотехнология

Генная инженерия - отрасль молекулярной биологии и генетики, задача которой - конструирование генетических структур по заранее намеченному плану, создание организмов с новой генетической программой. Возникновение генной инженерии стало возможным благодаря синтезу идей и методов молекулярной биологии, генетики, биохимии и микробиологии. Основные принципы генной инженерии были разработаны в 60-70-х годах XX столетия. Они включали три основных этапа: а) получение генетического материала (искусственный синтез или выделение природных генов); б) включение этих генов в генетическую структуру, которая реплицируется автономно (векторную молекулу ДНК), то есть создание рекомбинантной молекулы ДНК; в) введение векторной молекулы (с включенным в нее геном) в клетку-реципиента, где она монтируется в хромосомный аппарат (рис. 1.68).

Рис. 1.68. Основные этапы клонирования ДНК человека:

1 - получение определенного гена; 2 - подготовка вектора; 3 - вмотування гена человека в вектор; 4 - проникновение рекомбінантно! ДНК в бактерию, где вместе с плазмідою реплицируется (воспроизводится) ген человека.

Экспериментальное переноса генов в другой геном называется трансгенезом. Он основывается на технологии рекомбинантной ДНК. В основе генной инженерии лежат различные методы манипуляций с молекулами ДНК.

Получение генетического материала. В современной генетике используются два способа синтеза генов вне организма - химический и ферментативный. Для химического синтеза необходимо иметь полностью расшифрованную последовательность нуклеотидов ДНК. Впервые синтезировал искусственный ген индийский ученый Г. Корана (1970) (рис. 1.69). Это был ген аланиновой тРНК дрожжей, который состоял из 77 нуклеотидов. В первых опытах он не проявлял функциональной активности, ибо не имел регуляторных участков. В 1976 г. удалось синтезировать ген тирозинової тРНК кишечной палочки, который состоит не только из структурной участка (126 нуклеотидных пар), но и регуляторных частей - промотора и терминатора. Этот искусственно созданный по специальной программой ген был трансплантированный в бактериальную клетку и функционировал как естественный.

Рис. 1.69. Г. Корана (Наг Gobind Khorana) (род. в 1922 г.)

Другим примером химического синтеза является синтез гена, который кодирует фермент расщепления лактозы. Синтезированный в пробирке ген был встроен в плазмиду и введен в бактерию; кишечная палочка приобрела способности усваивать лактозу. Однако химическим путем можно синтезировать небольшие по размеру гены прокариот. Синтез генов эукариот, которые состоят из тысячи и более нуклеотидов, путем химического синтеза создать пока не удалось.

Ферментативный синтез генов осуществляют с помощью процесса обратной транскрипции. Открытие этого процесса сделано на пухлиноутворювальних РНК-содержащих вирусах. Однако впоследствии оказалось, что передача генетической информации с іРНК на ДНК может происходить в условиях эксперимента и с другими РНК. Именно это лежит в основе ферментативного синтеза гена. Упрощенно это можно представить таким образом: в пробирке на матрице ІРНК с помощью фермента обратной транскриптазы (ревертазы) синтезируется комплементарная к ней нить ДНК, затем образуется двониткова молекула ДНК. После этого іРНК разрушается ферментом рибонуклеазою, полученную ДНК называют ДНК-копию (кДНК). Такая кДНК не имеет вставок-интронов, т.е. схема ее строения не отличается от бактериального гена.

Матричная (информационная) РНК (мРНК) выделяют из клеток или тканей, в которых экспрессируется нужный ген. Так, для клонирование проінсулінового гена используют B-клетки поджелудочной железы, потому что именно для них характерно высокое содержание проінсулінової мРНК.

Ген, полученный в результате ферментативного синтеза, может функционировать в бактериальной клетке. На нем синтезируется ІРНК, а потом белок. Под руководством В. Энгельгардта был получен ген, который определяет синтез фермента галактозидазы. Этот ген вводили в фаг, при размножении которого в клетке получили множество копий, что обеспечило синтез большого количества фермента. Это имеет не только теоретическое, но и практическое значение, потому что галактозидаза применяется в пищевой промышленности.

Синтезированы гены глобина человека, кролика, голубя, некоторые гены митохондрий печени крыс и много других.

Гены, синтезированные с помощью ревертазы, не имеют регуляторной части и промотора. Отсутствие регуляторных участков препятствует функционированию этих искусственных генов в животных клетках. При переносе в микробную клетку в структурных генов экспериментально, по помощью ферментов, присоединяют промотор, который добывают из микробной клетки. Так были синтезированы два гены, ответственные за синтез цепей інсуліну. их вводыли в геном кишечной палочки, которая начала продуцировать инсулин. Важным достижением генной инженерии есть синтез гена соматостатина, который может функционировать в микробной клетке. Таким же методом под руководством Ю. О. Овчинникова и М. П. Дубинина осуществлен синтез генов, кодирующих нейрогормони человека (лейцин-энкефалин и брадикинин).

Ферментативный синтез генов имеет большое значение, потому что принципиально возможно проводить искусственный синтез любых индивидуальных генов путем транскрибирования их из соответствующих матричных РНК. Основным препятствием является синтез не структурных, а регуляторных частей генов, необходимых для их нормальной работы. Это в основном искусственно ограничивает использование синтезированных генов.

В генной инженерии широко используют так же и выделение природных генов с целью создания рекомбінативних молекул ДНК.

Включение полученного гена в вектор.

Вектор - это что-то вроде молекулярного "такси", способного переносить чужую ДНК внутрь бактериальной клетки таким образом, чтобы она там смогла реплікуватися. Существует два основных типа векторов: бактериальные плазмиды и бактериофаги.

После выделения или синтеза гена его сшивают с векторной (направляющей) молекулой ДНК. С этой целью используют особые бактериальные ферменты. Такие ферменты есть у бактерий, в которых они останавливают репродукцию вируса, вырезая вирусную ДНК из генома бактерии. Они называются рест - риктазами, поскольку ограничивают размножение вирусов. Каждый тип ферментов рестрикции, а их известно около 100, разделяет ДНК в специфическом месте, что называется сайтом рестрикции (рис. 1.70).

Рис. 1.70. Разделение двойного цепи ДНК.

В промежутке, что появился, может быть размещена участок чужеродной ДНК. Такую ДНК можно разрезать с помощью того же фермента рестрикции. Одноланцюгові комплементарные концы двух ДНК называют "липкими концами", потому что они соединяются вследствие комплементарного спаривание азотистых оснований. Они облегчают вставку чужеродной ДНК в векторную.

Таким образом, можно совмещать отрезки ДНК, полученные из разных источников, и создавать комбинации генов в одной длинной молекуле. Поскольку водородные связи легко разрываются, для соединения участков применяют фермент лігазу - один из ферментов репарации. Комбинируя различные рестриктазы и лигазы, можно разрезать нить ДНК в разных местах и получать рекомбинантные молекулы (например, плазмідну ДНК со встроенным чужим геном).

Втсраивания в геном реципиента.

Векторные молекулы, которые содержат в себе фрагменты чужеродной ДНК, должны иметь свойство, которое обеспечивает третий этап генной инженерии - проникновение в клетку-реципиента и втсраивания в ее геном. Реципиентные клетки, то есть клетки, выбранные для клонирование гена, могут быть как про-, так и еукаріотичними. Чаще всего для этой цели используют бактерии, поскольку их легко получать в больших количествах. Перенос генов может осуществляться из одной бактерии в другую помощью плазмид. Рекомбинантные молекулы ДНК отделяют от молекул, содержат только донорскую или только плазмідну ДНК. Для их разделения используется плазмида, имеющая два гены устойчивости к двум определенных антибиотиков. При этом клетки, которые растут при наличии двух антибиотиков, содержат только исходную плазмиду. Клетки, которые погибают под действием двух антибиотиков, лишены плазмид и содержат только донорскую ДНК. Клетки, растущие по наличии одного антибиотика и погибают при наличии другой, - содержат рекомбінантну плазмиду.

Если в плазмиду вмонтированы другие гены, они передаются в клетку-хозяина путем трансдукции и монтируются в ее геном (рис. 1.68), где способны к быстрой репликации с помощью ферментативной системы клетки-хозяина. Этот процесс быстрого получения большого количества одинаковых копий называется клонированием. Клон - это большая популяция идентичных молекул, бактерий, клеток, организмов, полученные от одного предка (рис. 1.71).

Рис. 1.71. Клонированные телята.

Клонирование генов - это процесс, включает выделение и амплификацию (дублирование большого количества) отдельных генов в реципієнтних о - и еукаріотичних клетках. Эти клетки, которые содержат нужный нам ген, можно использовать для получения: а) большого количества белка, что кодируется данным геном, или б) большого количества самого гена в високоочищеному виде.

Кроме плазмид, как вектор используются фаги (фаг лямбда), вирусы (обезьяний вирус SV40). В случае использования фагов и вирусов перенос генетического материала осуществляется с помощью трансдукции. Особым случаем трансдукции является перенос чужеродных генов в эукариотные клетки с помощью неонкогенных вирусов и фагов. Впервые предположение, что трансдукция возможна у эукариот, было высказано С. М. Гершензоном в 1966 г. при опытах на шовковичному шовкопряді.

Рекомбинантная ДНК-технология имеет как научное значение (позволяет выделить отдельный ген сложного организма и изучить его функцию на молекулярном уровне), так и практическое применение. С помощью рекомбинантной ДНК-технологии можно производить различные белки для медицинской практики. Такие лекарства более безопасны, чем аналогичные белки, полученные непосредственно из организмов. Первым таким рекомбинантным препаратом стал инсулин.

Другое важное направление биотехнологии - производство вакцин. Такие вакцины не могут вызвать болезней, потому что изготавливаются с одного из поверхностных белков. Ген такого белка используется для біореконструкції бактерии. Так создана вакцина против гепатита В. Успешно ведется работа над вакцинами для гепатитов А, С, хламідіозів, герпеса и других заболеваний.

Трансгенные организмы. С помощью методов генной инженерии можно получить различные организмы, которые имеют в составе своего генома чужеродные гены других организмов. Такие организмы называются трансгенными. В настоящее время эта отрасль науки быстро развивается.

В различных отраслях хозяйственной деятельности человека используются трансгенные бактерии. Кроме того, что бактерии используются для клонирование генов и производства белка, они реконструируются и для других целей.

Так, биоинженерные бактерии используются для оздоровления растений. Бактерии, живущие в растениях и стимулируют образование кристалликов льда, были изменены с холод-плюс на холод-минус растения. Такие бактерии начали защищать вегетативные части растений от мороза. У бактерий, образующих симбиоз с корнями кукурузы, были введены гены (от других бактерий), кодирующих токсин для вредных насекомых.

В природе существуют бактерии, могут расщепить любое органическое вещество. Бактерии отбираются по способностью расщеплять определенное вещество, а впоследствии эта способность усиливается вследствие биотехнологии. Таким путем были созданы бактерии, которые поедают нефть, разлившаяся в результате техногенных катастроф.

Бактерии используют для бактериального синтеза. Так, были реконструированы бактерии для производства аминокислоты фенилаланина.

Широкое использование рекомбинантных бактерий в сельском хозяйстве, промышленности, защите окружающей среды ограничивалось опасением того, что такие бактерии могут заменить природные микроорганизмы в экосистемах с возникновением неблагоприятных последствий. На настоящее время разработаны методы определения, измерения и даже блокирование деятельности этих клеток в окружающей среде.

Удобным объектом для генетических манипуляций оказались растения, потому что растительные клетки можно выращивать в культуре, где из каждой клетки получают целое растение.

Ведутся работы по созданию биоинженерных растений, которые могли бы иметь следующие свойства: 1) высокую приспособленность к условиям внешней среды; 2) содержать большее количество необходимых для человека питательных веществ; 3) длительное время храниться без порчи.

Разрабатываются трансгенные растения, способны продуцировать в интересах человека химические вещества и лекарства. Реконструирован картофель для продукции альбумина человека. Предполагается, что в будущем растения смогут образовывать в своих семенах такие белки, как гормоны человека.

Быстрыми темпами развивается биоинженерия животных. Яйцеклетку помещают в специальную мешалку вместе с чужеродной ДНК и мелкими силикон-карбідними иглами. Иглы делают множественные отверстия в оболочке, через которые ДНК попадает в клетку. С помощью этой технологии бычий гормон роста был введен в яйцеклетки многих видов животных. Благодаря этой технологии получены крупные рыбы, коровы, свиньи, кролики, овцы. Трансгенные животные созданы для производства продуктов медицинского значение.

Цепным инструментом для генетических исследований стали трансгенные мыши (рис. 1.72). Они дают важную информацию при планировании генной терапии у человека. Ученые изучают мышечную дистрофию Дюшена, выделили ген и его продукт - нормальный белок дистрофин, что отсутствует у больных. Предложен способ обеспечения больных детей дистрофином. Но что будет, если дистрофин попадет в другие ткани, или его будет образовываться слишком много? Для решения этих вопросов были созданы трансгенные мыши, в мышцах которых содержится дистрофина в 50 раз больше, а также происходит продукция этого белка в других тканях. Дистрофин не вызывает у таких мышей патологических отклонений.

Рис. 1.72. Трансгенные мыши.

Трансгенные мыши оказались крайне необходимыми при изучении моногенных болезней, злокачественных опухолей и даже мультифакториальных болезней человека.

Однако трансгенная технология есть неточной, потому что введение ДНК не направлено в определенный локус хромосомы. Ген, что переносится, может нарушить функцию другого гена или попасть под контроль других генов. Даже если трансген вставляется в хромосому и экспрессируется, его эффект может быть перекрыт таким же геном клетки-хозяина. Поэтому была разработана технология более точного "таргетинг" гена (gene targeting), при которой ген, что вводится, занимает место своего двойника в хромосоме клетки-хозяина. При этом используется естественный процесс гомологичной рекомбинации. Вследствие такой технологии заменяют инактивированным геном активный ген у мышей и прослеживают эффект его отсутствия даже в эмбриона. Так изучают функцию белков иммунной системы, механизм взаимодействия онкогенов в возникновении опухоли, развитие генетических заболеваний.

"Таргетинг" гена - сложная методология, она не работает в оплодотворенной яйцеклетке млекопитающих. Ген можно внедрить только в клетки на ранних этапах развития зародыша, к его имплантации в стенку матки. Клетки такого зародыша тотипотентні и много генов у них еще не експресовані.

"Таргетинг" гена имеет большое значение при создании моделей генетической патологии у животных. Важно то, что ученые идентифицируют версию человеческого апеля, который вызывает болезнь в животных. Затем соответствующий человеческий мутантный аллель переносится в эмбриональные стволовые клетки и, наконец, скрещивают животных, гомозиготных по инактивированным геном.

Животных с "выключенным" геном используют в изучении сложных болезней, в которых задействовано много генов. Так, например, изучают атеросклероз путем инактивации сочетания генов, продукты которых контролируют липидный метаболизм.

Геном мыши. Расшифровка генома человека в феврале 2001 года не дала ответы на все вопросы антропогенетики. Несмотря на секвенирование генома и определения приблизительного количества генов, кодируют белки, функция большинства из них остается неизвестной. В настоящее время не идентифицированы все гены, отвечающие за развитие наследственных болезней и болезней с наследственной предрасположенностью.

Расшифровка генома мыши, которую использовали в лабораторных исследованиях с 1900 г., в декабре 2002 года дала новые возможности для изучения генома человека.

Количество генов мыши составляет 27000-30500, что примерно соответствует количеству генов человека. Около 99 % этих генов имеют нуклеотидную последовательность, свойственную человеческому геному и-96 % из них находятся в "синтенних" участках хромосом мыши и человека.

В настоящее время возможен вывод трансгенных мышей с точным "выключением" (делецией) генов, тіроводити анализ изменений фенотипа, которые возникают вследствие этого, и впоследствии искать подобные нуклеотидные последовательности в геноме человека. Это ускорит идентификацию генов, отвечающие за развитие определенных нормальных и патологических признаков у человека.

Анализ нуклеотидной последовательности мыши позволит точно "нацеливать" гены человека в похожие нуклеотидные последовательности мыши и создавать "человеческие" признаки в лабораторных трансгенных мышах. Например, включены в геном мыши человеческие гены белков цитохромов, участвующих в метаболизме лекарств, позволят точно моделировать действие лекарств.