Раздел 1

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ ЧЕЛОВЕКА

1.2. Молекулярно-генетический и клеточный уровни организации жизни

1.2.3. Наследственный аппарат еукаріотичних клеток и его функционирования на молекулярном уровне

1.2.3.3. Реаплікація ДНК

Уникальное свойство молекулы ДНК удваиваться перед делением клетки называется репликацией. Это свойство обусловлена особенностью строения молекулы ДНК, состоящей из двух комплементарных цепей. Репликация происходит в ядре во время Б-периода интерфазы. На это время хромосомы под световым микроскопом не обнаруживаются.

Репликация ДНК - важнейший молекулярный процесс, что в основе всех разновидностей деления клеток всех типов размножения, а, значит, в основе обеспечения длительного существования отдельных индивидуумов, популяций всех видов живых организмов. Для каждого вида очень важно поддерживать постоянство своего генотипа и фенотипа, а значит, сохранять неизменность нуклеотидной последовательности генетического кода. Для этого необходимо совершенно точно воспроизводить молекулы ДНК перед каждым делением клетки, то есть основное функциональное значение репликации - обеспечение потомка стабильной генетической информации развития, функционирования и поведения.

Напівконсервативний путь репликации ДНК. Установлено (М. Мезельсон, Ф. Сталь), что в процессе репликации две нити ДНК разделяются, каждая из них является шаблоном (матрицей) для синтеза вдоль нее новой нити. Последовательность оснований, которые должны быть в новых нитях, можно легко предсказать, потому что они комплиментарны основам, присутствуют в старых нитях. Таким образом, образуются две дочерние молекулы, идентичные материнской. Каждая дочерняя молекула состоит из одной старой (материнской) нити и одной новой нити. Поскольку только одна материнская нить сохранена в каждой дочерней молекуле, такой тип репликации имеет название напівконсервативного (рис. 1.52).

Рис. 1.52. Напівконсервативний механизм репликации ДНК:

1 - родительская молекула ДНК; 2 - новая дочерняя молекула ДНК; С - материнский цепь; 4 - дочерний цепь.

Каждый из двух цепей материнской молекулы ДНК используется как матрица для синтеза новых комплементарных цепей.

Механизм репликации ДНК. Репликация ДНК - сложный, многоступенчатый процесс, требующий привлечения большого количества специальных белков и ферментов. Например, ініціаторні белки образуют реплікаційну вилку, ДНК-топоізомерази раскручивают цепи, ДНК-геліказа и дестабилизирующий белок расщепляют ДНК на две отдельные цепи, ДНК-полимераза и ДНК-праймаза катализируют полимеризацию нуклеотидтрифосфатів и образование нового цепи, ДНК-лигазы разрушают РНК-затравки на отстающих цепях ДНК и др. (рис. 1.53). Процесс происходит аналогично как у прокариот, так и эукариот, хотя несколько отличается по скорости, направленностью, количеством точек репликации т.д. Скорость репликации у эукариот очень велика и составляет 50 нуклеотидов за секунду, а у прокариот еще выше - до 2000 нуклеотидов в секунду.

Рис. 1.53. Процесс репликации ДНК:

1 - синтезированный цепь; 2 - матрица для синтеза ведущего цепи; 3 - ДНК-полимераза на ведущем цепи; 4 - ДНК-геліказа; 5 - дестабилизирующий белок; 6 - ДНК-праймаза;

7 - праймер; 8 - матрица для синтеза отстающего цепи; 9 - ДНК-полимераза на відстаючому цепи.

Точность репликации обеспечивается комплементарным взаимодействием азотистых оснований матричного цепи и цепи, что строится. Кроме этого, весь процесс контролируется ДНК-полимеразой, что же - корректирует и устраняет ошибки синтеза.

Основные этапы репликации:

1. Инициация (от лат. иnitialis - первичный, первоначальный). Активация дезоксирибонуклеотидів. Монофосфати дезоксирибонуклеотидів (АМФ, ГМФ, ЦМФ, ТМФ) находятся в состоянии "свободного плавания" в ядре и есть "сырьем" для синтеза ДНК. Для включения в ДНК они активируются в результате взаимодействия с АТФ. Эта реакция называется фосфорилуванням и катализируемая ферментом фосфорилазою. При этом образуются трифосфаты дезоксирибонуклеотидів, такие как АТФ, ГТФ, ЦТФ, ТТФ. В таком виде они енергезовані и способны к полимеризации.

Распознавание точки инициации. Раскручивание ДНК начинается с определенной точки. Такая особая точка называется точкой инициации репликации (специальная последовательность нуклеотидов). Для определения точки инициации необходимы специфические белки-инициаторы. У вирусов и прокариот является только одна точка инициации. У эукариот, имеющих большие молекулы ДНК, может быть много точек инициации репликации, что, в конце концов, сливаются друг с другом при полном разъединении цепей ДНК.

Репликация обеих цепей ДНК происходит одновременно и непрерывно.

Раскручивание молекулы ДНК. Двойная спираль ДНК раскручивается и разворачивается на отдельные нити ДНК путем разрыва слабых водородных связей между комплементарными нуклеотидами. Этот процесс обеспечивают ферменты - гелікази. Обнаженные основания А, Т, Г и Ц обеих цепей проектируются в каріоплазму.

Ферменты, названные топоізомеразами, разрывают и заново сшивают отдельные нити ДНК, помогают раскрутке спирали. Благодаря разделению цепей ДНК возникают реплікаційні вилки. Новые нити ДНК образуются на каждом из освобожденных цепей, их рост происходит в противоположных направлениях.

2. Элонгация. Свободные трифосфаты дезоксирибонуклеотидів своими азотистыми основаниями присоединяются водородными связями к азотистых оснований обеих цепей ДНК, согласно правила комплементарности, то есть А-Т, Ц-Г (рис. 1.54).

Рис. 1.54. Элонгация - основная реакция при синтезе новых молекул ДНК:

1 - новый синтезированный цепь; 2 - матричная цепь ДНК; 3 - рибонуклеотидтрифосфат, что поступает; 4 - основа.

Элонгация - это добавление дезоксирибонуклеоти - ду к З'-концу цепи, что растет. Процесс катализируется ДНК-полимеразой.

Трифосфаты дезоксирибонуклеотидів (тринуклео - тиди), присоединяясь к каждой цепи ДНК, разрывают свои внутренние высокоэнергетические связи и образуют монофосфати дезоксирибонуклео- тидів (мононуклеотиди), которые являются обычными компонентами ДНК. При этом в нуклеоплазму поступают пірофосфатні молекулы, что освободились (Г-Г).

Образования новых цепей ДНК. В дальнейшем присоединены соседние нуклеотиды связываются между собой фосфорными остатками и образуют новый цепь ДНК. Процесс катализируется ферментом ДНК-полимеразой. При этом необходимо присутствие ионов металлов Мn²+ или Mg²+. ДНК-полимераза может полимеризировать дезоксирибонуклеотиди в направлении 5-3', то есть от углеродного 5'-конца к углеродного'-конца молекул ДНК. Поскольку две нити ДНК является антипаралельними, новые нити должны образовываться на старых (материнских) нитках в противоположных направлениях. Одна новая нить образуется в направлении 5'-3'. Эта нить называется ведущей. На второй материнской нитке образуются короткие сегменты ДНК в направлении 3'-5'. Впоследствии они соединяются вместе, образуя длинную отстающую нитку (рис. 1.55).

Рис. 1.55. Образование праймеров второй цепи ДНК и синтез отстающего дочернего цепи:

1 - праймер; 2 - синтез отстающего цепи; С - синтез ведущей цепи; 4 - фрагмент Оказаки; 5 - синтезированные цепи ДНК.

Образование праймеров. На отстающем нити сначала образуется короткая цепь РНК по шаблону ДНК. Она называется РНК-праймером и содержит последовательность из 10-60 нуклеотидов. Фермент праймаза катализирует полимеризацию блоков РНК (А, В, Г, Ц) в праймері. РНК-праймер образуется потому, что ДНК-полимераза не может инициировать синтез новой нити ДНК в відстаючому цепи в направлении 3'-5', она только может катализировать ее рост. Праймеры позже удаляются, а полости, которые образовались, заполняются дезоксирибонуклеотидами ДНК в направлении 5'-3', что завершает строительство второй цепи. На месте праймеров образуются фрагменты новой цепи ДНК, которые называются фрагментами Оказаки и состоят из 100200 нуклеотидов. Эти фрагменты легуються (сшиваются) полінуклеотидлігазами, в результате чего образуется второй полноценный цепь. Этот процесс называется созреванием.

Редактирования. Четкая комплементарность пар оснований обеспечивает точную репликацию ДНК. Однако иногда возникают ошибки в присоединении основ. Они удаляются ДНК-полимеразой, которая для этого снова связывается с молекулами ДНК (репарация).

3. Терминация (от лат. terminalis - конечный). После завершения процесса репликации молекулы, образовавшиеся разделяются, и каждая дочерняя нить ДНК скручивается вместе с материнской в двойную спираль. Так образуются две молекулы ДНК, идентичные материнской. Они формируются отдельными фрагментами по длине хромосомы. Такой отдельный фрагмент ДНК, удваивается на одной хромосоме, называется репліконом. Возникает сразу несколько репліконів, причем асинхронно и в разных ее участках. Процесс репликации касается всей хромосомы и протекает практически одновременно, с одинаковой скоростью. После завершения репликации в реплі - конах они сшиваются ферментами в одну молекулу ДНК. В клетке человека, что делится, образуется более 50000 репліконів одновременно. Длина каждого из них 30 мкм. Благодаря большому количеству репліконів скорость репликации увеличивается в тысячи раз. Продолжительность процесса удвоения генетического материала составляет примерно 10 ч. Участки хромосом, где начинается репликация, называются точками инициации. Считают, что это, вероятно, места прикрепления интерфазных хромосом к белкам ламели ядерной оболочки. Процесс включается цитоплазматичним фактором неизвестной природы, которая поступает в ядро.. Репликация протекает в строго определенном порядке, то есть сначала начинают реплицированные одни участки хромосом, а позже - другие. В синтетическом периоде интер - фазы удваивается также и количество гістонових белков, что ассоциируются с синтезированными ДНК и образуют классическую структуру хроматина. Нарушение точности репликации приводит к нарушению синтеза белков и развития патологических изменений клеток и органов.

Значение репликации: а) процесс важным молекулярным механизмом, лежащим в основе всех разновидностей разделения клеток про - и эукариот; б) обеспечивает все типы размножения как одноклеточных, так и многоклеточных организмов; в) поддерживает постоянство клеточного состава органов, тканей и организма вследствие физиологической регенерации; г) обеспечивает длительное существование отдельных индивидуумов; д) обеспечивает длительное существование видов организмов; е) процесс способствует точному удвоению информации; ж) в процессе репликации возможны ошибки (мутации), что может приводить к нарушениям синтеза белков с развитием патологических изменений.